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定点敲入小(大)鼠


技术原理简介
       基因敲入(Knockin)鼠是指通过TALEN/CRISPR技术在目的序列位置引进特定的突变或外源基因的小鼠。通过针对基因靶序列设计相应的打靶质粒,然后根据需要插入或点突变的位置构建含Knockin片段或点突变的Donor质粒,将Donor质粒与打靶质粒共同显微注射进小鼠的受精卵中,TALEN/CRISPR定位到基因组上的靶序列并切割双链DNA,在随后的修复过程中,细胞以含同源序列的Donor质粒为模版修复基因组DNA,最终获得在目的DNA序列插入Knockin片段或点突变的Knockin小鼠。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型);或将报告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点,从而可以通过报告基因来跟 踪目标基因的表达;也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因,使KO/KI同时发生。

TALEN/CRISPR构建定点敲入小(大)鼠技术流程图

服务流程及周期


服务流程及周期图:

步骤   
内容  
 周期
敲入元件获得
客户提供或全基因合成根据实际情况而定
Cas9/gRNA的合成和同源模板(Donor)构建
 合成Cas9/gRNA,检测Cas9/gRNA活性,构建同源模板质粒 
2个月
得到FounderCas9/gRNA体外转录成mRNA和Donor质粒共同显微注射受精卵,胚胎移植到代孕母鼠子宫,3周后出生,2周龄基因型鉴定。2-3个月
得到F1代杂合子
 2个月后性成熟,Founder和野生型小鼠交配,3周后出生,2周龄基因型鉴定,获得稳定传代的基因突变杂合子F1代。 3-4个月