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miRNA研究全套解决方案


      北京唯尚立德公司拥有人类miRNA mimics 及antagomir文库(1000×2),小鼠miRNA mimics及antagomir文库(600×2),大鼠miRNA mimics及antagomir文库(500×2)。这些文库可以应用于大规模高通量筛选,助力广大科研同仁系统、高效的研究功能,完成项目。


服务内容:

情景一:鉴定miRNA的靶基因
一、萤光素酶(Luciferase)双萤光报告基因实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述:
构建包含miRNA靶位点的luciferase报告基因,与miRNA mimics共转到细胞当中,通过荧光素酶活性检测,即可分析出miRNA对潜在靶基因的调控作用,可用于miRNA调控潜在靶基因的验证。既可以小规模实验,也可高通量筛选。
原理图:

b、步骤流程:
1.预测miRNA的靶基因及靶位点
协助客户利用Targetscan,Pictar,miRNA.org,RNA22等常用软件预测miRNA的binding位点。

2.miRNA靶点鉴定

目的片段长度         

获得方法

周期

费用(RMB)

小于500bp(含)

PCR法

1-2周

 400

大于500bp

全基因合成

 2-3周

2.2/bp

 

ii、Luciferase报告基因构建:
  将目的片段组装到报告基因载体,1周,800/个。
   iii、miRNA表达载体构建:
  2周,可以扩增用于其他实验,800/个。
  推荐:miRNA mimics合成:1-2周,2 OD,赠送阴性对照,400/个。(二选一)
   iv、Luciferase实验:
  每个靶点都要做一个对照;每个样品包含内参和三组重复,根据样品数而定周期,400*2/个靶点。


成功实例:

图 1-2


二、Luciferase突变实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述:
对于前面有效果的miRNA靶基因,将miRNA的binding位点,尤其是seed区突变掉,造成miRNA无法结合,检测luciferase信号是否恢复。原理图:(如图1-1)
b、步骤及流程
   1.Luciferase报告基因构建:PCR法,每段突变20个碱基之内,1-2周
   2.Luciferase实验:每个样品包含内参和三组重复,根据样品数而定周期。

成功实例:

图 1-3

三、mRNA水平鉴定miRNA靶点
  a、实验目的:由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的mRNA水平变化将作为一个参考数据,用于分析miRNA作用靶点基因的机制。
  b、实验概述:对于前面有效果的miRNA靶基因,检测mRNA水平是否被miRNA下调。
  c、具体内容:将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时候,提取RNA,荧光定量PCR检测靶点基因的mRNA水平。900/个靶点+900/对照,2个靶点起订。

四、Western Blot实验鉴定miRNA靶点
  a、实验目的:由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的蛋白水平变化将作为一个参考数据,能全面反映靶点基因的蛋白表达水平的变化,结合mRNA表达水平变化,有助于分析miRNA作用靶点基因的机制。
  b、实验概述:对于前面有效果的miRNA靶基因,检测蛋白水平是否被miRNA下调。
Western Blot实验:每个样品包含内参,客户提供一抗。
  c、具体内容: 将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时后,裂解细胞进行Western Blot检测靶点蛋白的水平变化。800/个靶点+800/对照,2个靶点起订。
成功实例:

图 1-4


五、使用靶基因的siRNA验证靶点
实验概述:
  miRNA过表达会引起细胞表型的变化,例如迁移、增殖、凋亡,以及靶基因下游基因表达量变化等等。为了证明miRNA是通过负调控靶基因而引起的这些变化,可以使用靶基因的siRNA,检测是否会引起同样的变化。
详见基因沉默服务内容。

六、使用miRNA的抑制剂(Antagomir)验证靶点
  原理:miRNA antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂,通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合,阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对,抑制miRNA发挥作用。
  优势:与普通抑制剂相比,miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果,且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。(Antagomir的合成:单链的特殊修饰的RNA,2 OD)
  实验概述:对于内源有表达的miRNA,可以使用Antagomir,检测靶蛋白表达量是否恢复,检测是否会引起过表达miRNA相反的变化。对于内源没有表达的miRNA,可以先构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。

七、通过rescue靶蛋白检测功能来验证靶点
  实验概述:对于内源有表达的miRNA,可以构建cDNA表达质粒,过表达靶蛋白,检测是否会有rescue miRNA的抑制效果。对于内源没有表达的miRNA,可以构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。

八、miRNA靶基因信号通路总结
概述:利用prePPI,KEGG等生物信息学软件,总结性分析miRNA调控靶基因及下游信号通路。
成功实例:

图 1-5


情景二:已知现象,未知miRNA,发现您感兴趣的miRNA
内容:利用高通量筛选手段,针对您感兴趣的现象或者细胞行为,筛选出与此相关的miRNA。
详情见高通量筛选服务内容。

情景三:已知基因,鉴定调控它的miRNA
内容:构建包含目的基因3’UTR的luciferase报告基因,与候选miRNA mimics共转到细胞当中,通过荧光素酶活性检测,即可分析出miRNA对目的基因的调控作用,既可以小规模实验,也可高通量筛选。