CN EN
您当前所在的位置: 网站首页 >> >我们的业务 >> 基因编辑技术服务 >> 基因敲除细胞系构建服务

基因敲除细胞系构建服务


预试验:(一个月) 
  1、细胞的转染效率:尝试各种转染方法,如Lipo2000、LTX、电转等,以期找到转染效率相对高的方式。
  2、药筛浓度检测:如果转染效率不高,而过流式对细胞损伤很大,需要做抗性筛选,检测出杀死细胞的筛选药物的最小浓度。
  3、单克隆培养情况:观察细胞是否可以单克隆培养,起码需要两周时间培养才能检测单克隆培养周期。这个周期很大程度影响了细胞的检测周期。
  4、细胞中目标基因存在多个拷贝,这样的敲除将大大增加了工作的难度。


问题与分析: 
一、敲除的不确定性:
  1、设计多个靶点都没有内源活性,可能是切割区域内存在染色质复杂结构,建议换一个新的区域。(参考文献NAR,2014年
  2、筛选一轮需要检测100-200个单克隆细胞,约一个月时间。要拿到纯合子一般需要多轮筛选
二、致死基因的敲除风险:
  1、致死:如细胞周期调控基因、House keeping基因等,敲除后有可能导致细胞死亡或者状态不佳。因此无法获得纯合子的细胞株。
  2、关键基因:这些基因的敲除有可能导致细胞的生长状态不佳。
  3、其他:少数基因获得纯合子后,在增殖过程中,生长状态会变的越来越差,最终导致无法运输。


 敲除方案:  

步骤

服务内容

配套产品

预试验

详见上面


选择打靶技术

TALEN(优先)

CRISPR/CAS9(有脱靶风险)


设计靶点

一般在不同转录产物的共同外显子上设计9个靶点,靶点位置尽量在基因CDS的前1/3,ATG之后,不在最后一个exon上,最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成3个,时间紧的可一次上6个甚至9个


选择打靶载体

转染效率低的选择带荧光或药筛标记的载体

e-TALEN构建试剂盒CAS9构建试剂盒

内源活性初步验证

转染细胞,72h后提基因组,在靶点左右两边设计合适引物(建议一边250bp,另外一边150bp,也可以两边长度相同)。分两组:突变型的细胞和野生型细胞,PCR产物要单一,PCR产物的长度400-500bp。然后胶回收PCR产物,定量,分别取等量的突变型和野生型PCR产物自然退火杂交,用T7E1酶切并跑胶检测,如果野生型没有杂带,而突变型出现杂带,则证明打靶质粒是有活性的,突变比例可以通过定量条带亮度来估算。

T7E1酶

内源活性测序鉴定

将前面的野生型和突变型PCR产物送测序,通过测序图谱来进一步确认是否发生突变,主要查看测序的峰形图,在靶点位置附近是否开始出现杂峰。


单克隆筛选

无限稀释到每孔1个细胞的数量,每株细胞铺至少4个96孔板。细胞长好后,一部分送去做单克隆细胞的基因型鉴定,剩下继续扩大培养或者冻存。基因型鉴定参考内源活性初步验证和测序鉴定的方式。


获得突变型

扩增至10的五次方,冻存多管



细胞基因敲除敲入订单表Ver1.0