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药物靶基因高通量筛选


     药物与机体生物大分子的结合部位即药物靶点。药物作用靶点涉及受体、酶、离子通道、转运体、免疫系统、基因等。此外,有些少数药物通过其理化作用或补充机体所缺乏的物质而发挥作用。现有药物中,超过50%的药物以受体为作用靶点,受体成为最主要和最重要的作用靶点;超过20%的药物以核酸为作用靶点;20%药物的作用靶点尚有待进一步研究。

       传统的实验方案:获得药物处理后的细胞与未处理的细胞,裂解并作mRNA 芯片或者蛋白芯片,选取其中表达量明显下降或者明显被抑制的信通路作为候选,然后去研究这些基因或者信号通路的功能以及与药物的相互作用关系。

       我们的策略是直接在功能上研究,通过siRNA 沉默候选基因筛选得到功能基因。siRNA 和药物联合使用可以筛选到能够起到增敏作用的靶基因或者合成致死的靶基因,为靶向治疗和联合用药提供了重要依据。基于全基因组siRNA 文库的高通量筛选,可平行分析成千上万条基因功能,大大加快研究进程,从而能迅速、全面地鉴定出细胞过程或信号传导途径的相关基因,以及疾病相关的药物靶基因,保证研究成果更为系统和新颖。


已知药物功能筛选其靶基因的方案(基于siRNA 功能筛选)

1.  明确该药物功能,明确该药物药效达到一半时的工作浓度IC50。

2.  选取与此项功能相关的信号通路,设计合成siRNA,建立文库。每个基因设计合成3条siRNA。如涉及面广,可直接使用全基因组siRNA文库。如果小规模试筛,可以考虑选取激酶siRNA文库,700个基因。或者G蛋白偶联受体(GPCR)siRNA文库,400个基因。

3.  开展筛选工作工作组:药物和siRNA共筛,药物浓度为IC50。对照组:只加siRNA筛选。参考两组实验结果,选取其中可以与药物协调作用并增加药效的siRNA,其靶基因即为药物候选靶基因。如果多个siRNA都起作用,并且在一个信号通路上,则该药物抑制整个信号通路。

4.  靶基因验证:药物处理细胞后检测候选靶基因的表达量是否降低,以及功能是否缺失。


已知功能基因筛选调控该基因的miRNA 方案

1.  人类miRNA mimics 文库构建:约1100 条,或由客户定制。

2.  荧光素酶报告基因载体构建:根据目的基因3‘UTR 的长度而定,一般每300-800bp 构建一个载体。

3.  筛选:建议使用293T 或者Hela 细胞系,96 孔板筛选。每个报告基因载体都要将miRNA 文库筛选一遍。每孔共转染报告基因质粒,miRNA mimics,内参renilla 质粒。以不干扰任何基因的siRNA NC 为阴性参照。48 小时后裂解细胞,使用酶标仪测量luciferase 活性。活性降低的为阳性miRNA。


相关细胞表型检测实验


细胞迁移检测

使用SAMcell 细胞迁移芯片进行细胞迁移研究:每组至少3 组平行实验(尤其适合大规模实验和高通量筛选)。可有效避免Transwell法的误差。

使用Transwell进行细胞迁移研究:每组至少3个平行实验。(至少5个样本起订,不满5个按5个计算)

细胞浸润检测

使用Transwell进行细胞浸润研究:每组至少3个平行实验。(至少5个样本起订,不满5个按5个计算)

细胞活力检测MTT 试剂盒检测法(至少10 个样本起订,不满10 个按10 个计算)
CCK-8 试剂盒检测法(至少10 个样本起订,不满10 个按10 个计算)
细胞增殖检测Ki67 试剂盒检测法(至少10 个样本起订,不满10 个按10 个计算)
EDU 试剂盒检测法(至少10 个样本起订,不满10 个按10 个计算)
细胞凋亡检测TUNEL 试剂盒检测法(至少10 个样本起订,不满10 个按10 个计算)
Anexin-V 试剂盒检测法(至少10 个样本起订,不满10 个按10 个计算)
其他检测方法客户提供或者委托购买试剂盒、抗体、染料等


已验证效率文库产品:

1.  人类全基因组siRNA 文库:约21000 个基因,每个基因对应3 条 siRNA,分别为A,B,C 三个亚库。siRNA 序列设计参考美国著名siRNA 生产商,3'末端采用特殊修饰。分装在384 孔板中,规格为每孔5-8pmol,氩气保护,铝膜封装,-80 度储存。

报价:总价40W,单买一个亚库15W。货期:1 周。

2.  人类激酶siRNA 文库:约700 个基因,每个基因对应3 条 siRNA,分别为A,B,C 三个亚库。siRNA 序列设计参考美国著名siRNA 生产商,3'末端采用特殊修饰。分装在96 孔板中,规格为每孔20-25pmol,氩气保护,铝膜封装,-80 度储存。

报价:总价8W,单买一个亚库3W。货期:2-3 周。

3.  人类磷酸化酶基因siRNA 文库:约300 个基因,每个基因对应3 条 siRNA,分别为A,B,C 三个亚库。siRNA 序列设计参考美国著名siRNA 生产商,3'末端采用特殊修饰。分装在96 孔板中,规格为每孔20-25pmol,氩气保护,铝膜封装,-80 度储存。

报价:总价4W,单买一个亚库1.5W。货期:1-2 周。

4. 人类miRNA 模拟体文库:约1100 个miRNA序列参考miRbase, 3'末端采用特殊修饰。分装在96 孔板中,规格为每孔20-25pmol,氩气保护,铝膜封装,-80 度储存。

报价:5W。货期:2-3 周。

5. 人源cDNA 克隆文库:约11000 个基因甘油菌液,壮观霉素抗性,分装在96 孔板中,氩气保护,铝膜封装,-80 度储存。

报价:15W。货期:1-2 周。


Real-time PCR 检测siRNA 干扰效率:

以siRNA 文库中随机挑选一个基因为例,针对一个基因三条siRNA 混合成pool,转染后24 小时提RNA 检测,沉默效率>70%。


Real-time PCR 检测miRNA mimics 过表达效率:

以miRNA mimics 文库中随机挑选一个为例,转染后24 小时提RNA 检测miRNA, 表达量提高500 倍以上


芯片产品信息

1.  人类激酶siRNA 文库芯片:约700 个基因,每个基因对应3 条 siRNA,混合在一起。siRNA 序列设计参考美国著名siRNA 生产商,3'末端采用特殊修饰。8X8 点阵排列在芯片上,小孔直径约800um,点阵间距约2250um。芯片置于3.5cm 细胞培养皿中,蜡固定。阴性参照siRNA 设置8 个复孔,每基因设置4 个复孔。每张芯片容纳14 个基因。

报价:2.5W。货期:2-3 周。

2.  人类磷酸化酶基因siRNA 文库芯片:约300 个基因,每个基因对应3 条 siRNA,混合在一起。siRNA 序列设计参考美国著名siRNA 生产商,3'末端采用特殊修饰。8X8 点阵排列在芯片上,小孔直径约800um,点阵间距约2250um。芯片置于3.5cm 细胞培养皿中,蜡固定。阴性参照siRNA 设置8 个复孔,每基因设置4 个复孔。每张芯片容纳14 个基因。

报价:1.25W。货期:2-3 周。

3. 人类miRNA 模拟体文库芯片:约1100 个miRNA mimics。序列参考miRbase, 3'末端采用特殊修饰。8X8 点阵排列在芯片上,小孔直径约800um,点阵间距约2250um。芯片置于3.5cm 细胞培养皿中,蜡固定。阴性参照miRNA mimics 设置8 个复孔,每miRNA 设置4 个复孔。每张芯片容纳14 个miRNA。

报价:2.25W。货期:2-3 周。

                                                     



                                                                                        FAM 标记siRNA 验证交叉污染:几乎零污染