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T7 核酸内切酶 I (T7 endonuclease I, T7E1 )



货号      

规格

价格

#E001S      

300 units

500.00元

#E001L 

1500 units

2,200.00元

浓度

5,000 units/ml  

储存   

-20℃

反应条件  

 37℃温育




编号

组成

E001S 

E001L

1

T7E1       

300U

5×300U

2

10× T7E1 buffer 

200μl

5×200μl

3


阳性DNA
与引物

Control引物(10μM )

20μl

20μl

4

Control C(10ng/μl )

40μl

40μl

5

Control G(10ng/μl)

40μl

40μl


应用
■ 基因突变和SNP的检测,可应用于TALEN、CRISPR/CAS9形成的突变体检测
■ 识别错配 DNA,分解四方向交叉 DNA 或分支 DNA
■  检测或切割异源二聚体 DNA 和切割 DNA
■  随机切割线性 DNA 进行 shot-gun 克隆


概述
T7 核酸内切酶 I 识别并切割不完全配对 DNA、十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链DNA 或者以更慢的速度切割或切刻双链 DNA。该酶切割错配碱基 5′ 端的第一、第二或第三个磷酸二酯键。


来源
重组T7 核酸内切酶 I (T7 endonuclease I, T7E1 )


反应条件
Buffer [50 mMNaCl,10 mMTris-HCl,10 mM MgCl2,1 mM DTT(pH 7.9 @ 25℃)], 即同1X NEBuffer 2,37℃温育。


质保声明
T7 核酸内切酶 I 经过严格的质控检测,确保该产品具有最高的活性和纯度。请使用前务必仔细阅读本手册。


单位定义
1 单位指在50 μl反应体系,37℃,1 小时将1 μg超螺旋十字型结构的pUC(AT)质粒酶切成 90% 以上的线性DNA所需要的酶量。


注意事项
T7 核酸内切酶 I 是一种具有底物结构选择性的酶。该酶以不同的活性作用于不同的 DNA 底物。切割特定底物时,必须控制酶量和反应时间。反应温度超过 42℃时,会增加非特异性核酸酶活性。避免反应温度超过55℃,会导致酶活性降低。
T7E1酶切法检测突变体实验步骤
1、PCR扩增出带有突变位点(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site) DNA片段,长度约500bp,突变位点最好不位于PCR片段中央,这样将切割出两条大小不同的带。
2、突变体DNA与野生型DNA的PCR产物按如下体系进行混合,进行加热变性、退火复性处理。


编号

1

2

3

突变体DNA PCR产物

5μl

2.5μl

0

野生型DNA PCR产物

0

2.5μl

5μl

10X T7E1 Buffer

1.1μl

1.1μl

1.1μl

ddH2O

4.4μl

4.4μl

4.4μl

Total

10.5μl

充分混合后,退火


3、建议退火程序:(PCR仪)
        95℃ 5 min
        95℃ 2 sec
        -0.1℃/cycle, 200 times    
        75℃ 1 sec
        -0.1℃/cycle, 600 times
        16℃ 2 min
4、上述反应体系退火后分别加入0.5μl T7E1酶,37℃反应30 min后,立刻跑2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。(放置时间过长可能会导致PCR产物全部降解。)



图. 非配对内切酶法-T7E1法检测突变体的突变率。

 突变型带:大约300+200 bp

 野生型带:大约500 bp

 突变率=突变型带/(野生型带+突变型带)(按照带的灰度计算)

 


阳性参照

阳性参照是一个碱基的点突变检测。
使用本试剂盒提供阳性参照引物的混合物:
Control-GC-F    ACACCTGATCAAGCCTGTTC
Control-GC-R    CGCCAAAGAATGATCTGCG
分别以阳性DNA Control C和Control G为模板,PCR扩增出600bp的阳性DNA片段,点突变标示如下:

阳性参照可以分别单独PCR扩增后, PCR产物等量混合,或者混合DNA模板进行PCR扩增,PCR产物进行加热变性、退火复性处理后,用T7E1酶切,产生400bp+200bp两个端片段。


使用限制
本试剂仅限用于科学研究。


储存与安全
本品4℃运输,储存于-20℃,有效期12个月。长期储存请置于-80℃。
本品采用蓝冰运输,蓝冰在使用前在-80℃冷冻至少72小时。实验证明,使用上述方法运输,即使到货时蓝冰已经融化,泡沫塑料盒中的温度仍然能保持在4℃或4℃以下24小时。比较干冰运输的产品,其活性和稳定性无任何差异。产品纯化整个过程都在4℃进行,且其贮存液经过优化,对保持酶活的稳定性起到重要作用。产品中含有50%甘油,可以使酶在-35℃下保持液态,若使用干冰运输,酶将被冷冻,发生反复冻融可能会导致酶


T7E1酶切法进行基因敲除小鼠的基因型鉴定

T7 核酸内切酶 I