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TALEN 植物/酵母基因敲除双元载体


TALEN 植物基因敲除双元载体

1.  合成的TALEN将构建到下面两个载体中

     pCS2-peas-T

     pCS2-Perr-T


     TALEN质粒对构建好后, 命名为: pCS2-Gene-L and pCS2-gene-R


pCS2-peas-T or pCS2-perr-T 质粒图谱


2.    TALEN 质粒对构建好后, 将采用SSA luciferase 报导基因方法检测活性。 TALEN活性检测合格后,要把TALEN的ORF分别构建到植物双元载体中:pTALEM-L and pTALEM-R (单子叶植物); or pTALED-L 与 pTALED-R (双子叶植物), 最后组装成到一个质粒。(或者顾客购买我们的植物双元载体,并自行构建; 或者顾客委托我们进行构建)。

   pTALED-L 与 pTALED-R 用于转化双子叶植物 (例如拟南芥、西红柿、烟草) 靶向基因操作;

       pTALEM-L与pTALEM-R用于转化单子叶植物(例如水稻等) 靶向基因操作。


       这些双元载体以pCAMBIA-1301为骨架改造而成,35S promoter驱动TALEN基因的表达, Hygromycin作为筛选标记。

植物TALEN双元载体构建示意图(5’UTR用于提高TALEN的表达)


3.   构建方法(以pTALEM-L and pTALEM-R (单子叶植物)为例): 

      1) 将pCS2-Gene-L用NcoI+XbaI 酶切,产生3K+4K的两条带,跑胶回收约3k带,插入到用NcoI+XbaI的pTALEM-L载体上(酶切仅有一条带)。质粒命名为:pTALEM-gene-L。

      2) 将pCS2-Gene-R用NcoI+XbaI 酶切,产生3K+4K的两条带,跑胶回收约3k带, 插入到用NcoI+XbaI的pTALEM-R载体上(酶切仅有一条带)。质粒命名为:pTALEM-gene-R。

      1 )and 2) 步可同时做。

      3) 将pTALEM-gene-R用HindIII+AscI酶切后,产生4.3K+8.4K的两条带,跑胶回收约4.3k带, 插入到用HindIII+AscI酶切的pTALEM-gene-L质粒中(酶切仅有一条带)。质粒命名为: pTALEM-gene-LR。用于下一步的植物转化。


注:

      1. 由于TALE为大量重复序列,请用DH5a or XL10-Gold宿主菌(该菌原产Stratagene,但现在国内的全式金-Transgen也有销售)进行构建。

pTALEM-L质粒图谱

pTALEM-L 质粒图谱

pTALED-L质粒图谱

pTALED-R质粒图谱



TALEN 酵母基因敲除双元载体

1.   合成的TALEN将构建到下面两个载体中:

      pCS2-peas-T

      pCS2-Perr-T


      TALEN质粒对构建好后, 命名为: pCS2-Gene-L and pCS2-gene-R

pCS2-peas-T or pCS2-perr-T 质粒图谱


2. TALEN 质粒对构建好后, 将采用SSA luciferase 报导基因方法检测活性。 

    TALEN活性检测合格后,要把TALEN的ORF分别构建到真菌双表达载体上:pY26-GPD-L and pY26-TEF-R, 最后组装成到一个质粒。(或者顾客购买我们的真菌双表达载体,并自行构建; 或者顾客委托我们进行构建)。


3.   构建方法:

      1)  将pCS2-Gene-L用NcoI+XbaI 酶切,产生3K+4K的两条带,跑胶回收约3k带,插入到用NcoI+NheI的pY26-GPD-L载体上(酶切仅有一条带)。质粒命名为:pY26-GPD-gene-L。

      2)  将pCS2-Gene-R用NcoI+XbaI 酶切,产生3K+4K的两条带,跑胶回收约3k带, 插入到用NcoI+NheI的pY26-TEF-R载体上(酶切仅有一条带)。质粒命名为:pY26-TEF-gene-R。

        1 )and 2) 步可同时做。

      3) 将 pY26-TEF-gene-R 用BglII+NotI 酶切后,产生7.4K+3K 的两条带,跑胶回收约3k 带, 插入到用 BglII+NotI 酶切的pY26-GPD-gene-L 质粒中(酶切仅有一条带)。质粒命名为: pY26-Gene-LR


注:

      1. pY26-GPD-L and pY26-TEF-R 为URA 筛选标记,请用URA 营养缺陷型真菌做基因敲除操作。

      2. 由于 TALE 为大量重复序列,请用DH5a or XL10-Gold 宿主菌(该菌原产Stratagene,但现在国内的全式金-Transgen 也有销售)进行构建。



pY26-GPD-L质粒图谱

pY26-TEF-R 质粒图谱